湖州市科技攻关计划项目(2011GG11)
- 作品数：4 被引量：8H指数：2
- 相关作者：袁雪梅徐洋尹文林姚嘉赟郝贵杰更多>>
- 相关机构：浙江省淡水水产研究所宁波大学更多>>
- 发文基金：湖州市科技攻关计划项目湖州市自然科学基金浙江省科技厅重大科技专项重点农业项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- GCRV及其细胞灭活苗对草鱼4种酶活性的影响被引量：1
- 2014年
- 以G1组1×106TCID50/mL、G2组1×103TCID50/mL两种不同浓度草鱼呼肠孤病毒通过腹腔注射感染草鱼,G3组用草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗注射免疫草鱼,并设计对照组:用相同体积的PBS腹腔注射草鱼,分别在注射后1、2、7、14 d取血清及肝脏,测定其酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性,通过各项酶活力变化规律来研究病毒感染及疫苗免疫对草鱼非特异性免疫功能的影响。结果表明:ACP活性,与对照组比较血清中各处理组变化不显著,肝脏中大体呈现先降低后升高的趋势;AKP活性,血清中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2、G3组呈现持续升高的趋势,肝脏中G1、G2组均呈现先降低再升高再降低的趋势,G3组呈现先升高再降低的趋势;MPO活性,血清中G1组呈上升趋势,G2组呈先升高再下降的趋势,G3组呈现升高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先降低再升高再降低的趋势,G2组与G3组均呈现先升高再降低的趋势;SOD活性,血清中G1组呈现先升高再降低的趋势,G2组呈现升高的趋势,G3组呈现先高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2组呈现降低的趋势,G3组呈现先降低后升高的趋势。结果显示:MPO及SOD两种酶活性在G1、G2及G3血清中变化趋势不一,说明这两种酶活性跟刺激物浓度及种类存在一定关系。
- 袁雪梅沈锦玉蔺凌云潘晓艺姚嘉赟徐洋尹文林郝贵杰
- 关键词：草鱼草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗酶活性
- 草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7真核重组质粒的构建及免疫效果评价被引量：2
- 2015年
- 为研究开发草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)基因疫苗,以编码其主要衣壳蛋白VP7的序列为靶基因,克隆构建了真核表达重组质粒p EGFP-N1-VP7。用脂质体法将其转染真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及特异性RT-PCR检测结果表明,成功转染并得到了高效表达。大量扩增重组菌,提取并制备重组质粒p EGFP-N1-VP7,肌肉注射免疫(20±5)g的健康草鱼,重组质粒按0.5和5μg分为2组,同时设5μg空载体组及对照组。免疫草鱼22d后,检测草鱼肠、外周血、肾脏、脾脏的呼吸暴发活性及淋巴细胞的增殖反应;免疫草鱼21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后,分别尾静脉采血并分离血清,用双抗体夹心ELISA方法进行抗体水平的测定。结果表明,构建的含VP7蛋白的核酸疫苗既可诱导草鱼的细胞免疫,又可诱导特异性体液免疫,具有明显的免疫应答作用。按照每尾0.5μg重组质粒的剂量免疫草鱼后35d进行攻毒,免疫保护率达到67%,此研究为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。
- 郝贵杰袁雪梅潘晓艺徐洋姚嘉赟蔺凌云尹文林沈锦玉
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白真核表达体液免疫
- RT-PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究被引量：5
- 2013年
- 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)为草鱼出血病的病原.本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法.该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120 nmol/L,最适退火温度为52℃.PCR特异性试验表明:所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA.敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性.用所建立的RT-PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT-PCR检测方法可靠且可行.
- 郝贵杰盛鹏程林锋潘晓艺徐洋姚嘉赟尹文林曹铮袁雪梅蔺凌云沈锦玉
- 关键词：逆转录聚合酶链式反应细胞病变效应
- 绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达
- 2013年
- 应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞(CIK)中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达。在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质。转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列。结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础。
- 郝贵杰潘晓艺袁雪梅姚嘉赟徐洋蔺凌云尹文林沈锦玉
- 关键词：绿色荧光蛋白转染草鱼出血病
