国家自然科学基金(30270514)
- 作品数：14 被引量：33H指数：4
- 相关作者：时德吴忠均郑树森李德卫骆旭东更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第一医院浙江大学医学院附属第一医院大庆油田总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建被引量：3
- 2006年
- 目的:为开展C型利钠肽基因治疗,克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法:通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中,用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3.1(+)酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间,并且未发现有碱基突变或移位。结论:含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定,为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。
- 肖乐赵渝时德
- 关键词：C型利钠肽真核表达质粒基因治疗
- 联合转染tPA基因和PCNA反义寡核苷酸抑制兔自体移植动脉再狭窄研究被引量：5
- 2005年
- 目的研究血管局部联合转染组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)对自体移植动脉血管再狭窄的防治作用。方法120只新西兰雄性白兔,按数字表法随机均分为4组(对照组、PCNA-ASODN组、tPA组、tPA+PCNA-ASODN组)。将同一只兔的左、右髂外动脉(各1.0cm长)对换移植,移植血管及吻合口缝线分别用pBudCE4.1/tPA和PCNA-ASODN液浸泡。于术后3、7、14、28及56d取移植血管制片,显微镜下观察内膜增生情况,计算机图像分析测量其内膜面积和移植血管狭窄率,扫描电镜观察移植血管壁血栓形成情况,并分别用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测tPA基因的mRNA表达率与PCNA阳性细胞百分率。结果术后3、7、14和28d时,tPA组与tPA+PCNA-ASODN组的tPA基因mRNA表达率明显高于另2组(P<0.01),PCNA-ASODN组、tPA组和tPA+PCNA-ASODN组PCNA阳性细胞百分率均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。tPA+PCNA-ASODN组和PCNA-ASODN组、tPA组各时相血管壁内膜增生比对照组明显减轻,内膜面积和管腔狭窄程度显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),且tPA+PCNA-ASODN组又明显低于另2组(P<0.05)。扫描电镜观察显示,tPA组和tPA+PCNA-ASODN组血管壁只见少量血小板附着,未见血栓形成,而对照组血管壁可见大量血小板附着,且有血栓形成。结论血管局部联合转染tPA基因和PCNA-ASODN能有效抑制VSMC增殖和血栓形成,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。
- 吴忠均李昱时德郑树森
- 关键词：组织型纤溶酶原激活物反义寡核苷酸联合转染再狭窄
- 联合转染反义PDGF寡核苷酸和tPA基因抑制血管内膜增生的实验研究被引量：1
- 2005年
- 目的:观察血管局部联合转染血小板源性生长因子(PDGF)反义寡核苷酸(AODN)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因对自体移植动脉内膜增生的影响,并探讨其可能机制。方法:选100只新西兰雄性白兔,随机分为4组(每组25只):A组(对照组)、B组(PDGF-AODN转染组)、C组(tPA基因转染组)、D组(PDGF-AODN和tPA基因联合转染组)。将同一只兔的左、右髂外动脉(各1.0cm)对换移植,移植血管分别用PDGF-AODN和pBudCE4.1/tPA液浸泡,血管吻合口用上述液体浸泡过的缝线吻合。每组按实验终点(术后3d、1w、2w、4w和8w)分为5个亚组,术后各实验终点取移植血管标本,用于病理学检测、电镜观察、发色底物检测tPA活性实验3、H-TdR掺入实验和免疫组织化学染色检测。结果:术后各时间点D组移植血管的内膜面积、管腔狭窄程度、3H-TdR掺入量和PDGF阳性细胞数均显著低于A组(P<0.01),而且亦明显低于B和C组(P<0.05)。扫描电镜观察显示C组和D组血管壁只见少量血小板附着,未见血栓形成,而A组和B组血管壁可见大量血小板附着,且有血栓形成。术后3d、1w、2w、4w时C组与D组的tPA基因表达产物活性明显高于A组(P<0.01)。结论:血管局部联合转染PDGF-AODN和tPA基因能有效抑制VSMC增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。
- 吴忠均时德李德卫郑树森
- 关键词：寡核苷酸类组织型纤溶酶原激活物
- 转染VEGF165基因抑制兔动脉损伤后内膜增生被引量：1
- 2005年
- 目的:观察局部转染血管内皮生长因子165(VEGF165)基因对损伤动脉内膜增生的影响并探讨可能机制。方法:采用显微外科手术方法,建立兔右髂外动脉损伤模型。将105只新西兰大白兔随机分为3组,每组35只。A组为生理盐水对照组,B组为脂质体介导的pBudCE4·1转染组,C组为脂质体介导的pBudCE4·1/VEGF165转染组。用微注射器将各种转染液注入损伤的血管壁,每组按实验终点(术后2、3、7、14和28d)分为5个亚组,每个亚组7只兔。于术后各实验终点,取损伤段的血管用于病理组织学检查、电镜观察、RT-PCR和免疫组化染色检查。结果:术后各时点C组血管内膜厚度和内膜面积均显著小于A组和B组(P<0·01),术后28d时C组管腔狭窄率平均比A组和B组低51·6%和49·8%。术后各时点C组血管壁的VEGF165基因的mRNA表达量和血管壁VEGF165阳性细胞率明显高于A组和B组(P<0·01)。C组血管壁血管内皮细胞(VEC)修复和生长增殖速度明显快于A组和B组。A组和B组间无明显差异。结论:局部转染VEGF165基因可抑制血管新生内膜增生及血管再狭窄,为将来血管内膜增生的基因治疗奠定基础。
- 吴忠均时德郑树森李德卫
- 关键词：内皮生长因子基因内膜增生
- tPA基因局部定位转染抑制兔动脉损伤后内膜增生的研究被引量：3
- 2005年
- 目的: 观察局部转染组织型纤溶酶原激活物 (tPA)基因, 对手术损伤兔右髂外动脉后内膜增生的影响并探讨可能的机制。方法: 采用显微外科手术方法, 建立兔右髂外动脉损伤模型。将 105只新西兰大白兔随机分为 3组, 每组 35只。A组为生理盐水对照组, B组为脂质体介导的pBudCE4. 1转染组, C组为脂质体介导的pBudCE4. 1 /tPA转染组。用微注射器将各种转染液注入损伤的血管壁, 每组按实验终点(术后 2、3、7、14、28d)再分为 5个亚组, 每个亚组 7只兔。于术后各实验终点, 取损伤段的血管用于病理学检查、电镜观察、RT PCR和免疫组化染色检查。结果: 与A组和B组相比较, 术后各时间点C组血管内膜的厚度、内膜的面积和血管腔的狭窄率均显著减小 (P<0. 01)。术后 28d时, C组血管腔的狭窄率比A组和B组分别降低了 51. 5%和54. 2%。术后各时间点, C组血管壁的tPAmRNA的表达量明显高于A组和B组(P<0. 01), 在术后 7d到达高峰, 并持续到 28d。扫描电镜观察显示, C组的血管壁只见少量血小板附着, 未见血栓形成; 而A组和B组的血管壁可见大量血小板黏附聚集, 且有血栓形成。免疫组化染色显示, C组的血管壁血小板源性生长因子(PDGF)阳性细胞的百分率明显低于A组和B组(P<0. 01)。A组和B组之间相比较, 以上数据差异无显著性(P>
- 吴忠均冯虎翼李德卫时德郑树森
- 关键词：TPA血管损伤内膜增生血管再狭窄
- tPA和VEGF165基因共表达质粒的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
- 2005年
- 目的 构建携带人组织纤溶酶原激活物 (t PA)和血管内皮细胞生长因子 16 5 (VEGF16 5 )基因的真核表达质粒 p Bud CE4 .1/ t PA - VEGF16 5 ,并观察其在血管平滑肌细胞 (VSMC)中的表达。方法 从人心脏组织中克隆 t PA和 VEGF16 5基因。将 t PA和 VEGF16 5基因克隆至真核表达质粒 p Bud CE4 .1中 ,构建共表达质粒 p Bud-CE4 .1/ t PA - VEGF16 5。将 p Bud CE4 .1/ t PA- VEGF16 5转染 VSMC,用 RT- PCR法检测转染的 VSMC中 t PA和VEGF16 5 m RNA的表达 ,用 EL ISA法检测转染的 VSMC培养液中 t PA和 VEGF16 5蛋白质。结果 人 t PA和VEGF16 5基因的 RT- PCR产物分别为 1.9kb和 5 76 bp。经酶切鉴定证实 ,t PA和 VEGF16 5基因已克隆至真核表达质粒 p Bud CE4 .1中。以其转染 VSMC后 ,经 RT- PCR和 EL ISA检测发现 ,t PA和 VEGF16 5在 m RNA和蛋白质水平均有表达。结论 成功地构建了真核共表达质粒 p Bud CE4 .1/ t PA- VEGF16 5 ,并在 VSMC中表达 t PA和VEGF16 5。
- 吴忠均时德骆旭东李昱谢海洋郑树森
- 关键词：质粒组织纤溶酶原激活物血管内皮生长因子血管平滑肌细胞
- 联合转染反义c-myc寡核苷酸和组织纤溶酶原激活物基因预防损伤后动脉内膜增生的研究
- 2005年
- 目的观察血管局部联合转染c-myc反义寡核苷酸(AODN)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤后动脉内膜增生的影响。方法将同一只兔的左、右髂外动脉(各1·0cm)对换移植,移植血管分别用脂质体、c-myc-AODN和pBudCE4·1/tPA液浸泡,血管吻合口用上述3种液体浸泡过的缝线吻合。实验终点(术后3、7、14、28、56d)分为5个亚组,术后各实验终点取移植血管标本用于病理学检测、发色底物法检测tPA活性实验、3H-TdR掺入实验和免疫组织化学染色检测。结果术后各时间点联合转染组血管的内膜面积、管腔狭窄程度、3H-TdR掺入量和增值细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数均显著低于对照组(P<0·01),而且亦明显低于c-myc-AODN和tPA单独转染组(P(0·05)。结论血管局部联合转染c-myc-AODN和tPA基因能有效抑制内膜增生,防止损伤血管狭窄。
- 吴忠均吴维伟余林时德郑树森
- 关键词：反义C-MYC寡核苷酸组织纤溶酶原激活物基因动脉内膜增生
- 联合转染血管内皮生长因子165和组织纤溶酶原激活物基因抑制兔血管损伤后内膜增生的研究被引量：7
- 2005年
- 目的观察血管局部联合转染血管内皮生长因子165(VEGF165)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤动脉内膜增生的影响并探讨可能机制。方法采用显微外科手术方法建立兔动脉损伤模型;用微注射装置将基因转染液注入损伤血管壁,按实验终点(术后2d、1周、2周、4周和8周)分为5个亚组(每个亚组8只兔);术后各实验终点取损伤段血管用于病理学检测、电镜观察、RTPCR和免疫组织化学检查。结果术后各时间点基因转染组血管壁的VEGF165基因的mRNA表达量和tPA阳性细胞数明显高于对照组(P<0.01)。与对照组比较,术后各时间点基因转染组血管内膜面积和狭窄率均显著减小(P<0.01),术后8周时基因转染组管腔狭窄率比对照组降低了59.0%。结论局部联合转染VEGF165和tPA基因可抑制血管新生内膜增生及血管再狭窄。
- 吴忠均杨素芬郑树森时德李德卫骆旭东
- 关键词：组织纤溶酶原激活物血管内皮生长因子165联合转染血管损伤基因抑制VEGF165基因
- 人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究被引量：2
- 2006年
- 构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒 pcDNA3．1(+)／tPA,并研究其有无生物学活性．用 RT-PCR 法从人心脏组织中克隆 tPA 基因并将其克隆至真核表达质粒 pcDNA3．1(+)中, 对 pcDNA3．1(+)／tPA 进行酶切鉴定和测序．脂质体介导 pcDNA3．1(+)／tPA 转染血管平滑肌细胞, 分别用 Nothern Blot 和斑点印迹法从 mRNA 和蛋白质水平检测 tPA 的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性．成功克隆了人 tPA 基因并构建了 pcDNA3．1(+)／tPA 真核表达质粒, pcDNA3．1(+)／tPA 转染 VSMC 后,tPA mRNA 和蛋白质表达增加,所表达的 tPA 蛋白质具有纤溶活性．
- 吴忠均陈地龙石正洪李德卫郑树森时德
- 关键词：组织纤溶酶原激活物真核表达质粒平滑肌细胞
- 转染血小板源生长因子和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制移植血管狭窄的实验研究被引量：5
- 2005年
- 目的 探讨联合应用血小板源生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)防止移植血管狭窄的作用。方法 将同一只兔的左、右髂外动脉(各1 0cm)对换移植,移植血管用PDGF- AODN和PCNA -AODN转染;移植血管病理切片后测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并分别用原位杂交组织化学和免疫组织化学染色计数PDGF和PCNA阳性细胞数。结果 PDGF- AODN加PCNA- AODN组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和PDGF阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于对照组(P<0 .01),而且亦明显低于单独转染PDGF- AODN组或PCNA -AODN组(P<0. 05 ),PDGF AODN组和PCNA AODN组间差异无显著意义(P>0. 05 )。结论 联合应用PDGF AODN和PCNA- AODN能有效抑制血管平滑肌细胞增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。
- 吴忠均朱毅时德郑树森李德卫
- 关键词：增殖细胞核抗原反义寡核苷酸移植血管血管狭窄器官移植
