国家自然科学基金(30871111)
- 作品数：7 被引量：22H指数：4
- 相关作者：陈君敏曾志勇郑晓强肖萍萍叶德富更多>>
- 相关机构：福建医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金福建省教育厅资助项目福建省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 多发性骨髓瘤成骨细胞活性和Runx2的表达被引量：1
- 2011年
- 目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞(OB)分化过程中Runx2的表达,探讨MM骨形成障碍的机制。方法以4例有明显骨质破坏的MM患者为研究对象,2例缺铁性贫血和1例特发性血小板减少性紫癜为对照,体外诱导MSCs向OB分化,采用CCK-8试剂盒检测MSCs向OB分化过程中的增殖能力,以平均光密度值(AOD)表示;碱性磷酸酶(ALP)染色和钙结节(Von-Kossa)染色检测MSCs的OB形成能力,分别以IOD sum/Area sum值和平均钙结节个数表示;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测MSCs向OB分化过程中Runx2的表达,以Runx2/GAPDH平均光密度值表示。结果在MSCs向OB分化过程中,MM患者MSCs的增殖能力、ALP表达、钙结节形成能力、Runx2表达均明显低于对照组(P<0.01)。结论 MM患者骨髓MSCs向OB分化过程中的增殖能力和OB形成能力均下降,可能与Runx2的表达减低有关。
- 郑晓强陈君敏
- 关键词：多发性骨髓瘤间充质干细胞成骨细胞
- 体外RNA干扰下调DEPTOR表达对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响被引量：4
- 2013年
- 目的:研究探讨应用RNA干扰技术构建人DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果,并评价DEPTOR对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法:设计4个DEPTOR siRNA序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的hU6-MCS-CMV-EGFP(GV115)-shRNA慢病毒载体。重组质粒经PCR测序鉴定后,脂质体介导下转染293T细胞,Western blot检测DEPTOR的表达,筛选出干扰效果最佳的GV115-shRNA。将筛选的GV115-shRNA与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平及Western blot方法从蛋白水平检测DEPTOR的沉默效果。运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot分析cleaved caspase-3和cleaved PARP的变化。结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,成功筛选出最有效抑制DEPTOR表达的shRNA2序列,包装病毒后滴度达到1×109TU/ml。慢病毒感染RPMI-8226细胞后可表达EGFP,Real-time PCR和Western blot检测DEPTOR的表达明显下降。下调DEPTOR基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度(P<0.05),肿瘤细胞的凋亡率上升(P<0.01)。DEPTOR shRNA上调cleaved caspase-3、cleaved PARP和Bax表达,下调Bcl-2及PI3K/Akt信号通路的表达(P<0.01)。结论:成功构建了DEPTOR shRNA重组慢病毒载体,其转染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞后显著抑制了DEPTOR的表达。DEPTOR shRNA可以有效地诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖。PI3K/Akt信号通路可能参与了其凋亡过程。
- 张浩然曾志勇陈君敏
- 利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4被引量：6
- 2011年
- 目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。
- 阙文忠陈君敏
- 关键词：腺病毒GATEWAY技术人肝细胞生长因子NK4
- 骨髓瘤细胞抑制成骨细胞活性和Runx2表达被引量：1
- 2011年
- 目的建立MM细胞系(U266细胞株)和MSCs共培养体系,研究骨髓瘤细胞对MSCs增殖能力、OB形成能力和Runx2表达的影响。方法研究对象为2例缺铁性贫血和1例特发性血小板减少性紫癜。采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,培养3～5代后,诱导MSCs向OB分化,待细胞融合至60%～70%时,分两组,一组加U266细胞株共同培养(共培养组),另一组不加U266细胞株(对照组)。采用CCK-8试剂盒检测MSCs向OB分化过程中的增殖能力,以平均光密度值(AOD)表示;碱性磷酸酶(ALP)染色和钙结节(Von-Kossa)染色检测MSCs的OB形成能力,分别以IOD sum/Area sum值和平均钙结节个数表示;RT-PCR技术检测MSCs向OB分化过程中Runx2的表达,以Runx2/GAPDH平均光密度值表示。结果在共培养体系中,U266细胞株和MSCs共培养的前3d,MSCs增殖能力无明显变化,两组AOD值分别为0.731±0.020和0.805±0.152(P>0.05),至第6天,共培养组的MSCs增殖能力明显低于对照组,AOD分别为0.560±0.034和2.283±0.145(P<0.05)。与对照组相比,共培养组MSCs向OB分化过程中ALP的表达显著降低,IOD sum/Area sum值分别为0.138±0.038和0.376±0.044(P<0.01),钙结节的形成减少,平均钙结节个数分别为(6.7±2.75)个和(15.3±8.99)个(P<0.01)和Runx2的表达显著降低,Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.238±0.168和0.653±0.343(P<0.01)。结论骨髓瘤细胞可抑制骨髓MSCs向OB分化的增殖能力和OB形成能力,也抑制其Runx2表达。
- 郑晓强陈君敏
- 关键词：多发性骨髓瘤间充质干细胞成骨细胞
- 唑来膦酸对多发性骨髓瘤成骨细胞增殖及其RANKL/OPG表达的影响被引量：8
- 2011年
- 目的研究唑来膦酸对多发性骨髓瘤(MM)患者成骨细胞(OB)增殖及其细胞核因子κ-B受体活化因子配体(RANKL)和护骨素(OPG)表达的影响。方法取MM患者骨髓液密度梯度离心法分离单个核细胞,原代培养,贴壁传代后加入含维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的条件培养基,诱导成OB,采用不同浓度唑来膦酸处理培养的OB,分别作用24、48和72 h后,通过①细胞计数试剂盒(CCK-8)检测OB增殖;②RT-PCR检测OB RANKL和OPG mRNA表达;和③酶联免疫吸附实验(ELISA)检测相应细胞培养上清液中sRANKL和OPG浓度来考察唑来膦酸的作用。结果①OB用唑来膦酸处理后,OB的CCK-8实验吸光值呈不同程度升高。②唑来膦酸作用24 h和48 h后,OB RANKLmRNA表达变化不明显。作用72 h,低浓度(10-9 mol.L-1)唑来膦酸显示能降低RANKL mRNA表达(P<0.05)。OB培养上清的sRANKL浓度也呈现类似的变化。③唑来膦酸作用24 h后,OB OPG mRNA表达变化不明显。作用48h,呈不同程度增加,以10-8 mol.L-1浓度最明显(P<0.05)。作用72 h,呈不同程度增加,以10-7 mol.L-1浓度最明显(P<0.05)。结论唑来膦酸有促进OB增殖的作用;唑来膦酸可能下调OB RANKL表达,并且上调OPG表达。
- 肖萍萍陈君敏叶德富
- 关键词：唑来膦酸多发性骨髓瘤骨髓瘤骨病成骨细胞OPG
- DAPT对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖和凋亡的影响被引量：4
- 2012年
- 本研究旨在探讨DAPT对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226体外增殖的抑制作用及相关机制。用CCK-8法检测RPMI8226细胞的增殖率,用流式细胞术检测凋亡率,用Western blot法检测RPMI8226细胞Notchl、Hes1蛋白表达情况。结果表明,DAPT 0.5-5.0μmol/L作用于RPMI8226细胞24-72 h后,细胞增殖水平明显下降,呈时间和浓度依赖性(r=1.000)。不同浓度的DAPT能诱导RPMI8226细胞发生凋亡,与对照组相比差异有统计学显著性;随着DAPT浓度的增加,Notch1、Hes1蛋白的表达逐渐下调(rNotch=-0.979,rHes1=-0.988)。结论:DAPT能够抑制RPMI8226细胞的增殖,其机制可能与RPMI8226细胞中Notch1、Hes1蛋白的下调有关。
- 原莹莹曾志勇陈君敏
- 关键词：多发性骨髓瘤RPMI8226细胞DAPTNOTCH信号通路
- 人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定
- 2012年
- 目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。
- 曾志勇陈君敏
- 关键词：基因基因扩增破骨细胞真核细胞载体蛋白质类逆转录-聚合酶链反应
