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冯勇
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- 所属机构:上海交通大学附属第六人民医院
- 所在地区:上海市
- 研究方向:医药卫生
- 发文基金:国家自然科学基金
相关作者
- 张长青
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- 目的探讨RNAi技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1(MuRF-1)基因表达的效果,筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。方法根据大鼠MuRF-1基因的mRNA序列,设计4组干扰序列,即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000转染试剂将siRNA重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6,于转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR和Western blot或免疫印迹检测其对MuRF-1表达的抑制效果。MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA和蛋白质数据以x±s表示。对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析;多个样本均数的两两比较用LSD检验。结果(1)实时定量PCR显示四组干扰质粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF-1的mRNA的抑制率在转染后48 h分别为67﹪、31﹪、11﹪,20﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.527,P=0.024);72 h分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=19.088,P<0.001),与48 h相比,抑制效应更为明显,但以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显(t=8.201,P<0.001)。(2)使用Western印迹灰度分析显示四组干扰序列对基因MuRF-1的蛋白的抑制率在转染后48 h分别为61﹪、40﹪、9﹪和15﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.286,P=0.028);72 h分别为70﹪、54﹪、30﹪和46﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=3.731,P=0.042);与48 h相比,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应与对照组相比有显著性差异(tⅠ=3.256,P=0.009;tⅡ=2.512,P=0.03),但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异(P>0.05)。四对序列中,以siRNAMuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显。蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。结论成功筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒,即siRNA MuRF1-Ⅰ,为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。
- 朱志祥梁炳生冯勇达志峰丁洁韦建贾英伟
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- RNA干扰介导的FoxO3a基因下调延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩被引量：1
- 2015年
- 目的：探讨慢病毒转染RNAi技术介导的FoxO3a基因下调延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩的疗效。方法将36只SD大鼠随机分为对照组和实验组，各18只。切断两组大鼠右侧坐骨神经，建立右下趾长伸肌失神经肌萎缩模型。建立模型后于实验组大鼠失神经趾长伸肌注射50μl重组慢病毒载体Lenti-GFP-FoxO3a；对照组注射Lenti-GFP溶液50μl，注射后1、3周，每个时间点两组大鼠分别取3只，完整切除右侧趾长伸肌，于荧光显微镜下观察绿色荧光信号，每个时间点两组大鼠分别取6只，完整切除右侧趾长伸肌，观察肌细胞超微结构，检测肌肉总蛋白含量，测肌肉湿重维持率，RT-PCR检测FoxO3a基因，检测肌细胞横截面积。结果转染后1和3周，两组趾长伸肌中均可观察到大量GFP荧光信号。转染后1周实验组的肌肉湿重维持率、肌细胞横截面积、趾长伸肌肌肉总蛋白含量分别为（90.87±1.56）％、（937.63.42±17.63）μm2和（93.20±1.33） mg/ml，均明显高于对照组（77.73±2.21）%、（721.50±14.40）μm2和（74.74±1.45） mg/ml，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。RT-PCR检测实验组FoxO3a基因与对照组相比明显下调（P〈0.01）。转染后3周，上述各指标分别为（86.69±1.31）%、（843.10±16.44）μm2和（80.39±2.34） mg/ml，仍高于对照组，对照组各指标为（53.42±2.01）%、（633.90±12.90）μm2和（65.22±2.72） mg/ml（均P〈0.01）。超微结构显示，术后1周和3周，实验组退变的细胞核均少于对照组，核质染色均匀。结论 FoxO3a基因siRNA重组慢病毒在大鼠体内有较高的转染率，可有效抑制FoxO3a基因的表达。RNAi介导的FoxO3a基因下调可在大鼠失神经早期延缓失神经骨骼肌的萎缩。
- 张鉴秦春耀韦健张小丽李刚冯勇杜利兵梁炳生
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- 重组慢病毒介导心脏营养素-1基因转染延缓小鼠失神经骨骼肌萎缩被引量：4
- 2009年
- 目的探讨重组慢病毒介导的心脏营养素-1（cardiotrophin-1，CT-1）基因转染延缓小鼠失神经骨骼肌萎缩的疗效。方法将36只Swiss小鼠，随机分为实验组和对照组，每组18只，切断胫神经，建立右下失神经支配肌萎缩模型。于实验组和对照组失神经腓肠肌分别转染重组慢病毒载体Lenti-GFP-CT-1和Lend—GFP溶液20越（108TU／ml），转染后2,4周，每个时间点分别取3只小鼠，于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达、Westem blot检测CT-1的表达；取6只小鼠行单次收缩力、强直收缩力的检测，测定肌湿重、肌纤维横截面积，并观察肌纤维超微结构的变化。结果慢病毒转染2、4周，两组腓肠肌中均可见大量GFP表达。Western blot检测显示实验组失神经腓肠肌中有明显的CT-1表达（P均〈0．01）。转染2周，实验组肌肉单次收缩力恢复率、强直收缩力恢复率、肌湿重维持率和肌纤维横截面积分别为[（47．61±6．25）％，^-x±s，下同]、（56．08±5．47）％、（63．02±5．23）％、（1372．42±149．73）μm^2，均明显高于对照组，后者分别为（27．23±5．06）％、（30．78±4．67）％、（52．41±4．98）％、（1147．28±128．67）μm^2（P均〈0．01）；4周时，实验组上述各项指标分别为（33．13±4．76）％、（36．59±5．67）％、（51．46±5．36）％、（1209．12±142．57）μm^2，仍明显高于对照组，后者分别为（16．40±5．48）％、（15．35±4．08）％、（39．15±6．12）％、（989．45±136．12）时（P均〈0．01）。此外，实验组肌浆网的扩张程度明显减轻。结论慢病毒介导的基因治疗有较高的转染效率，其介导的CT-1基因转染能有效延缓小鼠失神经骨骼肌的萎缩，其疗效至少可以维持4周。
- 冯勇张高孟梁炳生马学晓李继峰顾玉东
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- 吻合血管的游离腓骨移植治疗股骨头坏死长期临床疗效评估
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- 目的 构建微小RNA-133a重组慢病毒载体,观察其转染后对L6成肌细胞增殖、分化及转录因子MEF2A的影响.方法 构建表达含微小RNA-133a基因的重组慢病毒载体,转染L6成肌细胞,以实时定量PCR（Taqman探针法）对微小RNA-133a基因表达水平进行检测;细胞计数试剂盒（CCK-8）试验评价微小RNA-133a过表达后对L6成肌细胞增殖的影响;倒置荧光显微镜观察L6成肌细胞增殖、分化的影响;Western blot法检测转录因子MEF2A表达水平的变化.结果 构建的微小RNA-133a重组慢病毒载体经质粒酶切和测序鉴定正确;与对照组比较,转染L6成肌细胞24h后,微小RNA-133a基因的相对表达量明显增加（P＜0.01）;L6细胞增殖数量明显增加（P＜0.01）,对L6成肌细胞的分化有明显抑制作用（P＜0.01）;MEF2A的表达量逐渐下降（P＜0.01）.结论 成功构建微小RNA-133a重组慢病毒载体并转染16成肌细胞后可高效表达微小RNA-133a,促进体外成肌细胞的增殖并抑制分化.
- 李波弓贺炜李文斌李永平冯勇贾英伟田江华李刚梁炳生
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- 血清淀粉样蛋白A在骨科领域中的应用被引量：5
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- 血清淀粉样蛋白A(SAA)是一类急性相蛋白,主要与高密度脂蛋白结合而发挥作用。SAA在机体多种组织内均有转录和表达,结合多种不同细胞因子,多途径参与并影响机体病理和生理过程。SAA表达改变不仅出现在炎性疾病中,更是出现在一些肿瘤等非炎性疾病中。SAA在多研究中被提及可以作为骨关节炎症和骨肿瘤的生物标志物。尽管已有研究涉及SAA抑制破骨细胞分化和成骨分化刺激以及破坏骨与关节软骨,但炎症-骨代谢-脂代谢之间联系的建立以及其中病理生理机制尚不清楚。该文就SAA在骨科学领域中的应用作一综述。
- 彭咲远王启阳高彦淳冯勇张长青
- 关键词：血清淀粉样蛋白A高密度脂蛋白急性炎症反应骨科疾病骨肿瘤
- 通过调节蛋白代谢延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究
- 马学晓张高孟于腾波冯勇陈伯华张国庆马近峰顾玉东
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- 关键词：
- 关键词：骨骼肌蛋白代谢
- RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响
- 2013年
- 背景:最近的研究发现,一些因子在失神经骨骼肌萎缩的过程中发挥关键性作用,其中"feak-headbox"(Foxo)转录因子是调控骨骼肌萎缩最关键的分子。目的:探讨 RNA 干扰技术体外抑制 FOXO3a 基因表达的效果。方法:6 孔细胞培养板中培养大鼠成肌细胞系 L6,使用 pEGFP-N1 与 siRNA 重组质粒等比例在Lipofectamine2000 介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将 2 μg FOXO3a 基因 siRNA 重组质粒转染L6,转染 48 h 与 72 h。结果与结论:① p EGFP-N1 与 siRNA 重组质粒转染后 48 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率。②实时定量 PCR 分析结果显示,转染后 48 h 和 72 h,干扰序列 FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对 FOXO3a mRNA 的抑制率与未转染对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05),转染 72 h 与 48 h 相比,抑制效应更为明显,并以 FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显。③Western 印迹灰度分析结果显示,转染后 48 h 和 72 h,干扰序列 FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对 FOXO3a 蛋白表达的抑制率与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05),转染 72 h 与 48 h 相比,抑制效应更为明显,与 mRNA 水平的影响一致。结果可见 RNA 干扰技术在体外能够明显抑制叉头蛋白转录因子 FOXO3a 基因的表达,FOXO3a 基因 siRNA 重组质粒转染其干扰序列对 FOXO3a 的 mRNA 和蛋白抑制效果尚不明确,这可为 RNA 干扰介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供一种新的思路。
- 丁洁梁炳生达志峰朱志祥韦建贾英伟冯勇
- 关键词：肌萎缩FOXO3A失神经基因表达国家自然科学基金
- 基于患者自评的成人髋关节功能评分系统的建立被引量：41
- 2018年
- 目的构建一项针对成人髋部疾病功能重建疗效评价的简易自评评分系统。方法经文献查阅、小组讨论初筛用于患者自评的髋关节功能评估备选指标。采用两轮德尔菲咨询法，邀请专家对包括疼痛、日常生活能力、行动能力、劳动能力、患髋总体状况自评得分等方面筛选指标的重要程度及进行评判和打分，并说明熟悉程度以及判断依据。第二轮测评时增加了量表内容完整性、合理性评价等内容。根据指标重要程度（均值、满分频率、变异系数三个指标）界值确定最终入选指标，计算两轮专家积极系数、权威系数、协调系数，确定各指标权重赋分形成最终的评分量表。结果28位和25位专家德尔菲咨询后分别收回有效反馈25份和24份，两轮专家积极系数分别为89．3％（25／28）、96％（24／25）。一、二级指标专家权威系数普遍超过0．85；指标重要程度专家协调系数（Kendall’s系数）普遍超过0．3，且第二轮协调系数更高，一致性较好。行动能力中的“乘坐公交车”选项不符合重要性界值要求被剔除。最终确定该评分系统（上海第六人民医院髋关节评分）由两部分构成：第一部分包括疼痛、日常生活能力、行动能力、劳动能力等四个维度共10项指标，并确定其赋分权重分数分别为45、25、21、9分以及确定了具体10项指标权重分；第二部分为患者对患髋总体状况自评评分（VAS评分，满分100分）；最后完整得分为第一、二部分累加，其中第一、二部分最终权重占比分别为85％、15％。结论经德尔菲法确立的患者自评上海第六人民医院髋关节评分简单实用，可作为髋关节功能重建临床疗效评估的参考工具。
- 陈圣宝徐峰冯勇贾伟涛胡海张长青
- 关键词：德尔菲技术髋关节
- 基因芯片检测健侧颈7移位术治疗小鼠全臂丛神经损伤后脊髓基因的表达变化被引量：1
- 2009年
- 目的检测健侧颈7神经根移位术后脊髓基因表达的变化,探讨神经根移位术后脊髓可塑性形成的机制。方法30只雄性C57BC/6小鼠,体重20 g,随机分为实验组与对照组,每组15只。实验组又分为3个亚组:损伤即刻修复3个月组,损伤3个月、修复3个月组,损伤1个月、修复6个月组,每组5只。按照上述分组在制作全臂丛损伤模型后行健侧颈7移位术,于不同时间点取材应用Biostar M-140s基因芯片检测小鼠脊髓组织基因表达的变化,并与对照组进行比较。结果损伤即刻修复3个月组,损伤3个月、修复3个月组,损伤1个月、修复6个月组脊髓组织分别有55,6和118个基因发生表达水平的改变。其中编码免疫球蛋白重链、chitinase 3的基因在损伤即刻修复3个月组和损伤1个月、修复6个月组均表达增加。编码血管紧张素、collagen、myosin的基因在损伤即刻修复3个月组表达减少,而在损伤1个月、修复6个月组表达增加。突触蛋白synaptotagmin和synaptobrevin在损伤3个月、修复3个月组基因表达改变不明显,而在损伤1个月、修复6个月组表达明显升高。结论健侧颈7神经根移位术能引起脊髓组织基因表达水平发生变化,这种变化呈时间依赖性。免疫应答发生于术后各个阶段,而突触可塑性的形成主要发生在术后6个月。
- 肇晖李继峰罗鹏波顾玉东冯勇
- 关键词：臂丛神经损伤神经移位颈7神经根基因芯片
