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汉坦病毒Vero细胞适应株的筛选及鉴定: 2024年; 目的探讨汉坦病毒(Hantataan virus,HTNV)PS-6株经乳鼠鼠脑传代后在Vero细胞上的适应性,并筛选出适应Vero细胞的高滴度HTNV。方法将HTNV PS-6株在乳鼠鼠脑内连续传代培养后,Vero细胞上连续传10代,观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并采用蚀斑法检测病毒感染性滴度,滴度升高后,采用蚀斑克隆纯化筛选单克隆病毒并检测病毒滴度;分别以0.01、0.05、0.1 MOI感染Vero细胞后绘制病毒生长曲线;Reed-Muench法计算病毒LD50;Western blot法鉴定病毒特异性;透射电镜观察病毒大小及结构;与HTNV PS-6株全基因组核苷酸序列及氨基酸序列进行比较分析。将筛选出的Vero细胞适应株V-PS-6经腹腔注射10只BALB/c雌性小鼠,濒死时解剖,取心、肝、脾、肾、脑、肺、小肠、肌肉等组织进行免疫组化分析。结果鼠脑传代毒株对Vero细胞具有较好适应性,初始病毒滴度为1.3 lgPFU/mL,随着传代次数增加,病毒滴度逐渐升高,稳定在7.5~7.9 lgPFU/mL;筛选出的适应株V-PS-6蚀斑边界清晰、圆润、肉眼可见,大小如针尖,LD_(50)为10-^(7.8),在相对分子质量约50 000处可见特异性蛋白条带,大小与适应前HTNV PS-6株相符;V-PS-6病毒直径为80~210 nm,与HTNV PS-6电镜结构未见明显差异,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为98.85%;V-PS-6病毒明显分布在小鼠肾脏、肝脏、小肠、后腿肌肉及心脏中。结论成功筛选出1株可较好适应Vero细胞的高滴度HTNV株,且具有良好的遗传稳定性,为后续HTNV Vero细胞疫苗的研发及相关机制的研究奠定了基础。; 管亚博邢坤鹏刘晨阳王颖杜翔宇陈娜娜张朔孙宏亮李景良; 关键词：汉坦病毒 VERO细胞蚀斑法病毒滴度

Vero细胞的生长代谢特征及动力学模型构建: 2024年; [目的]解决Vero细胞在大规模高密度培养过程中营养物质耗尽,代谢产物积累导致细胞生长受限的问题。[方法]固定床生物反应器培养Vero细胞,通过换液培养和灌流培养两种方式比较细胞增殖、营养物质的消耗、代谢产物的生成,基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程建立动力学模型,并根据实际检测数据,应用Origin软件进行非线性拟合。[结果]换液培养和灌流培养两种培养方式培养Vero细胞,两种培养方式达到的最大细胞密度分别是4.35×10^(6)/mL和4.34×10^(6)/mL,在对数生长期,细胞的生长速率分别是0.54 d^(-1)和0.67 d^(-1),葡萄糖的最大消耗量分别是14.95 g/d和17.1 g/d,谷氨酰胺的最大消耗量分别是2.725 g/d和3.7 g/d;Origin软件进行非线性拟合,得到的建模参数通过验证两种培养方式的细胞生长模型预测值与实验值拟合度较高。[结论]大规模培养Vero细胞,利用灌流培养的细胞生长速率较快,对营养物质的利用率较高,是理想的细胞培养方式;所建立的代谢动力学模型能较好的反应细胞在生长过程中的反应动力学过程。; 平玲顾朝剑吴易梅张立敏陈溢娟杨净思沈武玲; 关键词：VERO细胞 ORIGIN软件动力学模型

1株悬浮培养的Vero细胞驯化及其生物学特性研究: 2024年; 目的将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究。方法采用无血清培养和“摇床适应法”对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测。结果成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在24~72 h,平台期在108~144h之间,衰退期在144h以后,细胞PDT为36 h,细胞密度在14.01~14.88×10^(8)个/L之间,细胞平均圆度在0.73~0.75之间,细胞直径在12.12~14.44μm之间。Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感。结论悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长。STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别。为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究。; 付兰博阮朝列陈昶旭高羽鲍晓琳刘伯川周健李卫东; 关键词：VERO细胞成瘤性

新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较: 2024年; 目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。; 袁晶孙也婷许馨月王琳张立志; 关键词：新型冠状病毒灭活疫苗 VERO细胞内毒素

RD、KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较: 2024年; 目的比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒(enterovirus,EV)分离培养的敏感性,以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据。方法收集2019年昆明市某医院确诊手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患者粪便样本60份,分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV,并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对,鉴定EV基因型。结果共分离获得112株EV,分别属于11种基因型。其中RD细胞分离出26株Echo-11,6株Echo-6和Echo-30,2株CV-A4和CV-A10,1株CV-A6、CV-A16和Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2。结论RD细胞对大部分EV均敏感,KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。; 刘煜菡张名许丹菡郭伟冯昌增徐丽兰马绍辉; 关键词：肠道病毒细胞敏感性 VERO细胞 RD细胞

Vero细胞狂犬病疫苗Zagreb和Essen程序接种安全性、免疫原性的Meta分析: 2024年; 目的探讨Vero细胞狂犬病疫苗采用Zagreb和Essen程序接种后的安全性及免疫原性的差异。方法通过检索PubMed、Embase、Web of science、中国知网、万方、维普网等数据库,收集Vero细胞狂犬病疫苗Zagreb和Essen程序接种安全性、免疫原性的相关文献,采用RevMan 5.4软件进行Meta分析。结果共有9篇文献纳入分析。通过Meta分析对比了Zagreb和Essen程序接种Vero细胞狂犬病疫苗的安全性和免疫原性。Zagreb和Essen程序之间总体不良反应率,差异无统计学意义(RR:1.12,95%CI:0.92~1.32,P=0.26)。局部不良反应发生率和全身不良反应发生率在Zagreb和Essen程序之间,差异均无统计学意义(RR:1.13,95%CI:0.99~1.28,P=0.07;RR:1.12,95%CI:0.88~1.41,P=0.36)。在首针接种后7 d,狂犬病病毒中和抗体(RVNA)阳转率Zagreb程序高于Essen程序(RR:1.27,95%CI:1.20~1.35,P<0.000 01),具有统计学差异。然而,首针接种后14 d, RVNA阳转率Zagreb在Essen程序之间无统计学意义(RR:1.00,95%CI:1.00~1.01,P=0.66)。结论 Vero细胞狂犬病疫苗Zagreb较Essen程序安全性无统计学意义。首针接种后7 d,RVNA阳转率Zagreb程序高于Essen程序,但在首针接种后14 d, 2种程序RVNA阳转率无统计学差异。; 刘合钦苏锦锋赵韵芽芦颜陈军舒祥; 关键词：VERO细胞狂犬病疫苗 META 免疫原性

基于稳定表达萤火虫荧光素酶Vero细胞系体外病毒中和活性检测方法的建立及应用: 2024年; 目的建立一种基于稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)Vero细胞系的高通量检测方法,以评估样品的体外抗病毒中和活性。方法基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9靶向基因编辑技术,构建一种稳定表达fluc的Vero细胞系,在此基础上建立痘病毒和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染细胞活性检测方法,利用该方法评估痘病毒免疫血清及RSV单抗的中和活性,并与噬斑抑制法及细胞活力检测(adenosine triphosphate,ATP)法检测结果进行比较。结果成功构建了Vero-fluc细胞系,其细胞量与表达的fluc相关性良好(R^(2)=0.9948)。利用Vero-fluc细胞作为感染细胞验证的痘病毒中和活性检测方法具有良好的稳定性、可靠性[信噪比(signal/background ratio,S/B)=25],可满足高通量的检测需求(Z’=0.9),相比传统噬斑抑制法一致性强(R2=0.76),免疫血清的ID50值较噬斑法平均高出2倍。建立的RSV中和活性检测方法,检测的抗RSV单抗中和活性与ATP活性试剂盒检测结果一致,Vero-fluc细胞法在1∶103~1∶105的抗体滴度水平上抑制率显著高于ATP法。结论建立的基于Vero-fluc细胞系的病毒中和活性检测方法与传统方法相比,具有良好的相关性,结果可靠,且具有更高的灵敏度及检测通量,是一种通用型体外抗病毒中和活性评价方法。; 丁如霞李晓玉赵晨燕刘强姚佳维黄维金王佑春; 关键词：萤火虫荧光素酶 VERO细胞抗病毒活性中和活性

生物反应器微载体Vero细胞罐外消化放大培养对狂犬病病毒CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响: 2024年; 目的探讨微载体Vero细胞从30 L生物反应器经罐外细胞消化放大培养至300 L生物反应器对狂犬病病毒(rabies virus,RABV)CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响。方法将第140代Vero细胞于37℃培养72~120 h后,按1∶4的细胞密度比传代扩增至10层细胞工厂,继续培养72~120 h;将单层致密细胞消化后接种至30 L生物反应器,微载体7~10 g/L,培养温度37℃,pH(7.0~7.4),溶氧30%~80%,搅拌速度10~50 r/min,连续灌流培养72~120 h,共培养3批;微载体Vero细胞经罐外细胞消化后放大培养至300 L生物反应器,微载体5~8 g/L,培养温度37℃,pH(7.0~7.4),溶氧30%~80%,搅拌速度30~80 r/min,灌流培养72~120 h;按MOI=0.05接种RABV CTN-1Ⅴ株,每24 h收获病毒液1次,检测病毒滴度和抗原含量。结果30 L生物反应器微载体Vero细胞培养96 h后密度约为1×10^(7)个/mL;300 L生物反应器微载体Vero细胞培养96 h后密度约为7.4×10^(6)个/mL。病毒接种96 h达峰值,病毒平均滴度为6.8 lgLD50/mL,抗原平均含量为2.58 IU/mL。结论微载体Vero细胞从30 L生物反应器经罐外细胞消化放大培养至300 L生物反应器的工艺稳定可行,对RABV CTN-1Ⅴ株的产毒能力影响较小,可为RABV灭活疫苗大规模生产提供参考资料。; 杨敏宋远涛王玲徐晓文聪陈杰杉王月莉梁婧; 关键词：狂犬病病毒 VERO细胞生物反应器微载体

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱主峰右侧峰2蛋白鉴定: 2024年; 目的对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱(size exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)主峰右侧峰2蛋白进行鉴定,以明确该峰的蛋白成分,保证疫苗质量。方法将冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)进行SEC-HPLC分析,收集主峰右侧峰2,经超滤浓缩后,进行二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAM)烷基化和胰蛋白酶(Trypsin)酶解,产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析。结果冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白,单个蛋白匹配肽段数在59~79个之间;单个蛋白匹配特征肽段种数在6~12种之间;单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20~36次之间;鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40%~64.31%之间。参与统计的肽段共280个,质谱偏差均小于0.15 Da。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV,为疫苗颗粒解离物。; 张秋菊杨雪冯子祎赵博林洪娟田丽媛杨光刘畅李子莉孙宏亮; 关键词：蛋白鉴定

传染性支气管炎病毒诱导Vero细胞发生自噬促进病毒的复制: 2024年; 为探究禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)能否诱导细胞自噬及其对病毒复制的影响,本研究利用IBV细胞适应株CEA接种DF-1和Vero细胞,通过Western-blot、透射电镜和激光共聚焦显微镜检测自噬通路关键蛋白LC3和P62的表达和分布以及自噬小体的形成情况,并通过自噬抑制剂和诱导剂处理评估了自噬对IBV复制的影响。结果显示,IBV不能在DF-1细胞中诱导LC3的转化,但能够诱导Vero细胞中LC3-II和P62的水平升高,并能在Vero细胞中诱导形成自噬小体以及LC3-II向自噬体中的聚集,表明IBV能够诱导Vero细胞发生完整自噬。用自噬抑制剂渥曼青霉素和氯喹处理细胞能够抑制IBV诱导的自噬以及病毒的复制,而用自噬激活剂雷帕霉素处理则能够促进病毒的复制。综上所述,IBV能够在Vero细胞中诱导自噬的发生,从而促进病毒的复制。; 杨雪晴孙军峰李慧昕韩宗玺刘胜旺; 关键词：禽传染性支气管炎病毒自噬

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