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弓形虫RH株感染比格犬动物模型的建立: 2022年; 目的建立实验用犬人工感染人源强毒力型弓形虫的发病模型。方法将3只76日龄人工哺乳、正压隔离器内生长的实验用比格犬腹腔注射1.5×10^(7)个RH株速殖子,每日2次检测直肠体温、采集口腔拭子、直肠拭子,感染8 d后(8 dpi)安乐死所有动物。利用PCR检测拭子和血液中的弓形虫B1基因,利用荧光定量法检测8 dpi犬主要组织脏器中弓形虫529 bp重复片段的拷贝数,并对主要脏器进行组织病理学检测。结果结果表明3只实验犬在4~5 dpi均出现了一过性体温升高,轻微腹泻;2~6 dpi的咽拭子或肛拭子中能检测到弓形虫B1基因的核酸,且肛拭子阳性率高于咽拭子;8 dpi剖检后,均产生较多腹水;肝组织均出现明显的炎性变化;盲肠和肝中的弓形虫529 bp片段的核酸拷贝数最高。结论利用SPF级比格犬腹腔接种弓形虫RH株,主要引起一过性体温升高和短时腹泻,可导致肝组织变性和坏死,发病模型较温和。; 问婉欣陈洪岩韩凌霞; 关键词：刚地弓形虫比格犬

弓形虫RH株CDPK1蛋白表达及鉴定: 2022年; 为了研究刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)CDPK1的生物学功能,并深入了解其在免疫保护中所发挥的作用,本试验以弓形虫RH株cDNA为模板,表达CDPK1基因并鉴定其生物学功能。本研究将截短的CDPK1基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析;利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白,以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备抗CDPK1多克隆抗体;通过蛋白质印迹技术(Western blot)及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组蛋白的免疫活性。结果显示:从弓形虫RH株cDNA中扩增出489 bp截短的CDPK1基因片段,编码162个氨基酸,与GenBank中已知基因序列及氨基酸序列的同源性为100%;获得的重组蛋白CDPK1分子量约为44 kDa,且在37℃、180 rpm和IPTG浓度0.2 mmol/L条件下,重组蛋白可获得高效可溶性表达;Western blot分析发现,重组蛋白能被GST标签抗体识别,不能被感染弓形虫的犬阳性血清识别,说明此重组蛋白不具有反应原性;IFA结果显示,重组蛋白的抗血清能够识别刚地弓形虫的天然蛋白CDPK1,说明重组蛋白CDPK1具有良好的免疫原性,且证实其主要位于刚地弓形虫虫体的细胞质和细胞核。本研究成功获得重组蛋白CDPK1及CDPK1多克隆抗体,为CDPK1特性与功能的研究奠定基础。; 张曼玉蒋蔚陈芸刘旗段倩玉耿小玲王权; 关键词：弓形虫原核表达多克隆抗体免疫保护

弓形虫RH株感染鸡的致病性及冷藏样本的安全性评估: 弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种胞内寄生虫，其引发的弓形虫病呈世界性分布，对人类健康和畜牧业生产危害极大。建立稳定、可靠的弓形虫感染动物的方法，可为进一步研究弓形虫生理代谢过程、致病机理、防控药物筛选等...; 陈笑; 关键词：弓形虫安全评估

刚地弓形虫RH株速殖子体外入侵小鼠巨噬细胞系感染模型的构建被引量：3: 2021年; 目的建立刚地弓形虫(简称弓形虫)RH株速殖子体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,确定体外快速高效培养速殖子的方法。方法弓形虫RH株速殖子经昆明小鼠传代3次后,经5μm滤膜纯化计数后,与小鼠巨噬细胞RAW264.7、人包皮成纤维(HFF)细胞共培养。RAW264.7细胞与虫体数量比例分别为20:1、10:1、1:1、1:5,HFF细胞与虫体比例为1:1,设无虫对照组。分别于培养后10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、32 h、48 h时间点取样,高倍镜下观察共培养情况,瑞-吉氏染色观察速殖子的黏附入侵细胞情况。将速殖子以1.5×10^(6)个/瓶接种于RAW264.7 T25细胞培养瓶中共培养,待80%假包囊破裂后,收集速殖子并计数,计算速殖子产率。用0.4%台盼蓝染液染色后,计算培养体系的活虫率。回收的弓形虫速殖子继续感染新的RAW264.7细胞,将每代细胞中收集的速殖子以1×10^(6)个/只接种5只健康雌性昆明小鼠,同时以等量的第3代速殖子接种5只健康雌性昆明小鼠作为对照,记录每代小鼠的存活时间。应用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。结果当RAW264.7细胞与虫体比例大于10:1时,共培养24 h时可见细胞边界不清,胞质增加,出现大量小泡;共培养30 h时细胞大量死亡消失,未观察到游离弓形虫;当细胞与虫体比例小于或等于1:1时,共培养24 h时内胞质可见细密小颗粒,未见小泡;共培养30 h时假包囊破裂达90%以上,大量速殖子被释放至培养液中,可观察到速殖子体外发育的完整过程。速殖子与RAW264.7细胞以1:1的比例共培养0.5~1 h,约80%的速殖子侵入细胞,虫体可进入胞质和胞核,2~4 h后假包囊开始形成,8 h可见菊花状假包囊;24 h后假包囊开始破裂,32 h后细胞悬浮不贴壁,大部分假包囊破裂并释放出游离速殖子,虫体形态好,每瓶收获弓形虫速殖子6×10^(8)个,平均活虫率在92%以上。速殖子与HFF细胞共�; 张丽新赵桂华徐超肖婷孙慧李瑾刘功振尹昆; 关键词：刚地弓形虫速殖子

弓形虫RH株ROP18基因的原核表达及鉴定被引量：1: 2020年; 为了研究刚地弓形虫ROP18的生物学功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所发挥的作用,本研究进行了弓形虫RH株ROP18基因的表达与鉴定。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot及IFA鉴定重组蛋白的免疫活性。结果表明:以弓形虫RH株基因组DNA为模板,成功扩增出长约678 bp的ROP18截短基因,并构建了原核表达质粒pET-30a-ROP18,测序结果与GenBank参考序列比对,同源性为100%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白ROP18以包涵体形式存在,分子质量约为31 kDa,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L、37℃诱导表达6 h时,表达量最高;Western blot结果显示重组蛋白ROP18可被感染弓形虫的犬阳性血清识别,表明ROP18有良好的反应原性;IFA结果显示,ROP18主要分布于弓形虫速殖子的胞浆内,且棒状体常存在的部位呈现较强荧光。本研究成功获得重组蛋白ROP18及针对ROP18蛋白的多克隆抗体,为ROP18特性与功能的研究奠定基础。; 段倩玉蒋蔚陈芸张曼玉曹敬政王权; 关键词：弓形虫原核表达多克隆抗体

弓形虫RH株表面抗原SAG1对于HFF细胞黏附作用分析以及弓形虫感染调控宿主细胞凋亡的机制研究: 背景:弓形虫表面抗原SAG1参与虫株感染过程,而关于SAG1如何参与该过程目前尚不明确。细胞凋亡作为细胞程序性死亡的一种方式,对于维持机体稳态发挥重要的作用。研究显示胞内寄生性原虫刚地弓形虫能够通过多种路径抑制或促进宿主...; 周丽娟; 关键词：弓形虫 SAG1 凋亡

莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚体内外抗弓形虫RH株速殖子的效果分析被引量：3: 2020年; 通过弓形虫RH株速殖子在宿主体内和体外的感染试验,比较了莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚的抗弓形虫效果。体外试验:用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,评价了3种不同浓度的药物对人包皮成纤维细胞(HFF)毒性及增殖情况;在药物的安全浓度范围内,用5×10^4个弓形虫RH株速殖子感染5×10^5个HFF细胞,每种药物设置5个浓度梯度,培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖效果;以相对抑制率为指标,评估药物的体外抗弓形虫效果。体内试验:用5×10^4个弓形虫RH株速殖子接种小鼠,4 h后,3种药物分高中低剂量组进行灌胃给药,连续给药5 d后停药,观察并记录小鼠每天死亡情况;且每天每组随机抽取1只小鼠,检查腹腔液中速殖子量及停药后是否复发,评价药物体内抗弓形虫效果。体外试验结果表明:莫能菌素钠可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,效果优于蒿甲醚,而磺胺嘧啶的效果波动性较大。体内试验结果表明:莫能菌素钠显著延长小鼠平均存活时间,磺胺嘧啶次之,蒿甲醚最次。体内和体外试验结果均显示出莫能菌素钠能显著抑制弓形虫速殖子增殖,延长小鼠存活时间。本研究为后续抗弓形虫药物研究以及临床用药提供了参考依据。; 翟斌涛马元元谢世臣彭俊杰梁盼红朱兴全杨晓野贺君君; 关键词：弓形虫速殖子磺胺嘧啶蒿甲醚体外试验

刚地弓形虫RH株速殖子外泌体的分离与鉴定被引量：1: 2020年; 目的:分离与鉴定刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子外泌体。方法:收集弓形虫速殖子与人结肠癌SW480细胞共培养上清液,经离心、过滤,采用基于聚合物沉淀技术的试剂盒法分离外泌体;透射电镜观察外泌体形态特征,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体粒径大小,蛋白质印迹法检测外泌体经典标志分子CD63、HSP70以及弓形虫特异蛋白表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)、棒状体蛋白16(rhoptry protein 16,ROP16)、ROP18和致密颗粒蛋白1(dense granule protein 1,GRA1)。结果:从弓形虫与细胞共培养上清液中分离出囊泡样物质,其外形为圆形,有完整的膜结构,直径为30~150 nm;表达外泌体特异性蛋白CD63、HSP70;检测出弓形虫特异性蛋白SAG1、ROP16、ROP18和GRA1。结论:从弓形虫速殖子与SW480细胞共培养上清液中获得弓形虫外泌体。; 凌薇宋玉洁汪慧朱昱蓉袁琳马雨润程芳姜旭淦陈盛霞; 关键词：刚地弓形虫外泌体共培养

阿里红多糖对刚地弓形虫RH株速殖子体外感染小鼠腹腔巨噬细胞的影响被引量：1: 2020年; 目的探索药用植物阿里红多糖(fomes officinalis polysaccharides,FOPS)粗提物对刚地弓形虫(toxoplasma gondii,Tg)RH株速殖子体外感染小鼠腹腔巨噬细胞及虫体增殖和凋亡的影响。方法CCK-8法计算FOPS粗提物对小鼠腹腔巨噬细胞的IC50并筛选安全药物剂量;建立刚地弓形虫RH株速殖子与小鼠腹腔巨噬细胞接种比例为1∶5的体外感染模型,分设空白对照组、强感染对照组和高(400μg/ml)、中(200μg/ml)、低(100μg/ml)剂量组。Hochest 33258荧光染色观察虫体感染小鼠腹腔巨噬细胞6 h、12 h、24 h、36 h、48 h形态及感染率变化;相对定量PCR法检测各实验组弓形虫529基因表达水平并计算虫体相对增殖抑制率;Annexin V-FITC结合流式细胞术检测感染10 h时高剂量(400μg/ml)FOPS对培养上清中游离弓形虫凋亡的影响。结果FOPS粗提物对小鼠腹腔巨噬细胞的IC50为1038μg/ml,安全药物剂量为519μg/ml以下。Hochest 33258荧光染色发现高剂量组感染6 h时细胞爬片中TgRH株速殖子无法侵入巨噬细胞且出现核固缩强亮荧光凋亡现象,12 h内感染率仅(5.38±3.08)%,显著低于感染对照组。各药物组巨噬细胞感染率在各时间均低于感染对照组。48 h时中、高剂量组巨噬细胞感染率分别为(85.31±2.33)%和(67.58±3.47)%,低于感染对照组的(92.51±2.88)%,差异有统计学意义(F=150.4,P<0.05);低剂量组巨噬细胞感染率为(91.96±2.31)%,与感染对照组相比差异无统计学意义(F=0.46,P>0.05)。弓形虫529基因表达水平显示感染48 h时高、中、低剂量FOPS的相对增殖抑制率分别为(75.70±0.03)%、(45.65±0.08)%和(38.98±0.06)%。流式细胞术检测高剂量H-FOP药物组感染10 h时细胞上清中TgRH株速殖子细胞周期发现G1期前典型亚二倍凋亡峰,占弓形虫总数的20.44%。结论FOPS可抑制刚地弓形虫TgRH株速殖子体外对小鼠腹腔巨噬细胞的感染和细胞内增殖,并在感染初期有抑制虫体入侵巨噬细胞、诱�; 高剑齐瑞瑞李莹花唐云剑帕丽达·阿不力孜; 关键词：小鼠腹腔巨噬细胞刚地弓形虫凋亡

弓形虫RH株ROP16Ⅰ/Ⅲ基因缺陷虫株感染BALB/c鼠的致病性研究被引量：1: 2019年; 目的旨在深入研究弓形虫棒状体效应分子ROP16与虫株毒力及致病性的关系。方法采用弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ基因敲除RH株(RHΔROP16)攻击感染BALB/c小鼠,在感染后不同时间点与野生株感染鼠比较,动态观察感染动物发病症状、存活时间;HE染色观察脑组织、肺组织病理学差异,qRT-PCR检测脾细胞炎性及抑炎细胞因子表达水平。结果两组小鼠的发病症状无明显差异;经HE染色显微镜下观察小鼠肺部及脑部病理学改变亦未见无明显差异;qRT-PCR检测并用Graphpad分析两组虫株感染小鼠的脾细胞Arg-1、IL-10、IL-12、TNF-α及IFN-γ等细胞因子表达水平。数据表明在感染相同时间ROP16缺陷株感染小鼠Arg-1的表达量明显低于野生型虫株(P<0.05);而IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论Ⅰ型弓形虫RH株的ROP16Ⅰ/Ⅲ并非是决定急性感染期弓形虫毒力的唯一效应分子;ROP16Ⅰ/Ⅲ可诱导宿主Arg-1高表达,提示与巨噬细胞内虫体的增殖有关。; 何佳丽陈守斌崔雯王聪罗庆礼沈继龙王维; 关键词：弓形虫基因敲除

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